Идентификация эндотелиальных клеток-предшественников в кавернозном теле у крыс

Джун Сик Ли
В Санг Хван
Хён-Сук Ли
Ми Ын Ким
Янг Ву Сео
Квангсунг Парк
Аннотация
1. Введение
2. Материалы и методы
2.2. Иммуногистохимическое Окрашивание
2,3. Проточный цитометрический анализ
2,4. Статистика
3. Результаты
3.2. Локализация резидентных EPC в кавернозном теле
4. Дискуссия
Подтверждение
Конфликт интересов
Рекомендации

Biomed Res Int. 2014; 2014: 910564.

, 1, 2, 2, 1, 3 и 2, *

Джун Сик Ли

1Кафедра биологии, исследовательская группа BK21-Plus по технологии биологически активного контроля, Колледж естественных наук, Университет Чосан, Кванджу 501-759, Республика Корея

В Санг Хван

2Департамент урологии и Центр творческих биомедицинских наук BK21 PLUS, Медицинская школа Национального университета Чоннам, Научно-исследовательский центр сексуальной медицины, Национальный университет Чоннам, 8 Хак-Донг, Донг-Гу, Кванджу 501-757, Республика Корея

Хён-Сук Ли

Ми Ын Ким

Янг Ву Сео

3 Корейский институт фундаментальных наук, Центр Кванджу, Кванджу 500-757, Республика Корея

Квангсунг Парк

3 Корейский институт фундаментальных наук, Центр Кванджу, Кванджу 500-757, Республика Корея

Академический редактор: Казем М. Азадзой

Получено 2014 г. 2 июля; Пересмотрен в 2014 году, 17 сентября; Принято в 2014 г. 22 сентября.

Это статья с открытым доступом, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Аннотация

По-видимому, клетки-предшественники сосудистой стенки служат локальным резервуаром клеток для восстановления сосудов. Было выдвинуто предположение, что кавернозное тело может содержать эндотелиальные клетки-предшественники сосудистой стенки (EPC). В этом исследовании мы исследовали идентификацию и локализацию EPC в кавернозном теле в модели на крысах. Взрослых самцов крыс Sprague-Dawley использовали для выделения EPC из кавернозных тел. Чтобы проверить наличие и локализацию EPC, EPC-специфические маркеры (CD34, Flk-1 и VE-кадгерин) были оценены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Маркеры EPC были в основном экспрессированы в кавернозном синусоидальном эндотелиальном пространстве. EPC-маркер-позитивные клетки составляли около 3,31% кавернозного тела нормальной крысы по данным анализа FACS. Как показано с помощью конфокальной микроскопии, в кавернозном теле присутствовали CD34 + / Flk-1 + и CD34 + / VE-кадгерин + -положительные клетки. Наши результаты показывают, что регуляция EPCs кавернозного тела может быть новой терапевтической стратегией в лечении эректильной дисфункции.

1. Введение

Эрекция полового члена сдерживается сосудистыми, нервными и гормональными факторами, а также структурной целостностью кавернозного канала. Эндотелий кавернозных клеток и клеток гладких мышц играют решающую роль в сосудистой гемодинамике во время эрекции полового члена. Эндотелиальный монослой играет ключевую роль в физиологии эрекции; следовательно, любое клеточное или молекулярное нарушение эндотелиальных клеток приводит к эректильной дисфункции [ 1 ]. Недавние исследования показали, что частота и развитие эректильной дисфункции тесно связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток [ 2 ].

Эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) играют главную роль в формировании новых сосудов. EPCs - это популяция редких клеток, которые циркулируют в крови со способностью дифференцироваться в эндотелиальные клетки и образуют слизистую оболочку кровеносных сосудов [ 3 ]. Кроме того, EPC могут пролиферировать и участвовать в васкулогенезе. Несколько отчетов показали, что количество циркулирующих EPCs снижается у пациентов с эректильной дисфункцией [ 4 , 5 ]. Недавно клетки-предшественники сосудистой стенки были введены в качестве источника для постнатального васкулогенеза [ 6 ]. Эти клетки-предшественники сосудистой стенки, по-видимому, служат локальным резервуаром клеток для васкулогенеза. Также сообщалось, что остеогенные клетки-предшественники человеческой белковой оболочки могут происходить из стволовых клеток [ 7 ]. Кроме того, Traish et al. предположил, что андрогенная депривация способствует дифференцировке клеток-предшественников стромы в линию адипоцитов [ 8 ].

Предполагалось, что кавернозное тело содержит EPC сосудистой стенки. Поэтому мы стремились идентифицировать и локализовать EPC в кавернозном теле на модели самцов крыс.

2. Материалы и методы

2.1. животные

Взрослые самцы крыс Sprague-Dawley (12 недель, n = 20) были использованы в текущем исследовании. Ткань полового члена собирали для биохимических анализов, как описано ниже. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Медицинской школы Национального университета Чоннам.

2.2. Иммуногистохимическое Окрашивание

У крыс под кетаминовым наркозом кавернозное тело перфузировали холодным физиологическим раствором через брюшную аорту. Затем половой член был быстро удален и пещеристое тело было тщательно рассечено от уретры и окружающей соединительной ткани под оптическим увеличением. Средняя часть пещеристого тела была собрана для иммуногистохимической оценки. Образцы кавернозной ткани немедленно фиксировали 4% параформальдегидом в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS; 137 мМ NaCl, 27 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4 и 1,4 мМ KH2PO4) и крио-встраивали. Внедренные ткани разрезали по вертикали, и образцы подвергали иммуногистохимическому обнаружению CD34, рецептора-2 фактора роста эндотелия сосудов (Flk-1, VEGFR-2) и VE-кадгерина. Для выявления CD34, Flk-1 и VE-кадгерина срезы ткани промывали PBS-T (0,1% Твин в PBS). После нескольких промывок PBS срезы тканей пронизывали 5% сывороткой осла, промывали 0,1% тритоном X-100 в PBS для подавления периферической неспецифической реактивности и затем инкубировали с первичными антителами против CD34 и против Flk-1 (Santa Cruz Biotechnology , Калифорния, США) в течение ночи при 4 ° С. После промывания в PBS-T срезы инкубировали в течение 2 часов с антителами, конъюгированными с флуоресценцией (Invitrogen, Калифорния, США), для анализа конфокальной микроскопии. Срезы с иммуноокрашенной тканью закрепляли водной постоянной установочной средой с DAPI и исследовали с помощью световой микроскопии и конфокальной микроскопии. Конфокальные изображения были получены с помощью лазерного конфокального сканирующего микроскопа (TCS SP5 / AOBS / Tandem, Leica, Германия) в Корейском институте фундаментальных наук, Центр Кванджу.

2,3. Проточный цитометрический анализ

Выделенные клетки из части каждого полового члена собирали, промывали PBS и ресуспендировали в промывочном буфере для флуоресцентного сортировщика клеток (FACS) (1% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия в PBS). Сначала клетки блокировали 0,5% (об. / Об.) Нормальной козьей сывороткой в течение 15 мин при 4 ° С и окрашивали FITC-конъюгированными анти-CD34, PE-конъюгированными анти-Flk-1 и анти-VE-кадгериновыми антителами в течение 30 минут. мин при 4 ° С. Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA).

2,4. Статистика

Все результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение от указанного количества экспериментов. Статистическую значимость оценивали с использованием t- тестов, а различия сравнивали в отношении статистической значимости с помощью одностороннего ANOVA с последующим специальным тестом Бонферрони. Значение P 0,05 считалось значимым.

3. Результаты

3.1. Идентификация резидентных EPC в кавернозном теле

Мы оценили распределение EPC полового члена с помощью иммуноокрашивания и анализа FACS. Изолированные клетки полового члена окрашивали анти-CD34, анти-Flk-1 и анти-VE-кадгериновыми антителами для анализа проточной цитометрии. CD34 является маркером гемопоэтических стволовых клеток / клеток-предшественников, а Flk-1 и VE-кадгерин являются маркерами эндотелиальных клеток. Соответственно, клетки CD34 + / Flk-1 + и CD34 + / VE-кадгерин + указывают на EPC. Результаты показали, что EPC составляли приблизительно 3,31% (CD34 + / Flk-1 +) и 3,31% (CD34 + / VE-кадгерин +) от общей популяции половых клеток ().

Результаты показали, что EPC составляли приблизительно 3,31% (CD34 + / Flk-1 +) и 3,31% (CD34 + / VE-кадгерин +) от общей популяции половых клеток ()

Проточная цитометрический анализ экспрессии EPC-специфических маркеров в пещеристом теле крысы. Для определения наличия резидентных EPC в кавернозном теле крысы CD34 и Flk-1 использовали в качестве маркеров EPC, а двойные положительные клетки (EPC) измеряли с помощью проточной цитометрии. Как показано на рисунке, EPC составляли 3,31% (CD34 + / Flk-1 +) и 3,31% (CD34 + / VE-кадгерин +) кавернозного тела полового члена крысы. Результаты представляют четыре отдельных эксперимента. EPC: эндотелиальная прогениторная клетка. * Р <0,05 по сравнению с нормой.

3.2. Локализация резидентных EPC в кавернозном теле

Кроме того, локализация ЭПК была идентифицирована с помощью иммуногистохимии с антителами против CD34, против Flk-1 и против VE-кадгерина. Чтобы исключить циркулирующие ЭПК, мы удалили кровь путем перфузии физиологического раствора через брюшную аорту. Как показано на фигурах и, клетки CD34 / Flk-1 с двойной меткой и CD34 / VE-кадгерин с двойной меткой были локализованы в кавернозном синусоидальном эндотелиальном пространстве. Эти данные указывают на то, что резидентные EPC существуют в эндотелиальном слое кавернозного тела.

Эти данные указывают на то, что резидентные EPC существуют в эндотелиальном слое кавернозного тела

Двойная иммунофлуоресцентная детекция CD34, Flk-1 и VE-кадгерина в кавернозном теле крысы. Объединенные изображения представляют наложение окрашивания для каждого отдельного антигена. Двойные позитивные клетки CD34 / Flk-1 и CD34 / VE-кадгерин были локализованы в кавернозном синусоидальном эндотелиальном слое (стрелка). Иммунофлуоресцентные изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии. Данные представляют три или более независимых эксперимента.

4. Дискуссия

В эректильной ткани эндотелий, выстилающий сосудистое русло и трабекулы в половом члене, играет критическую роль в эректильной функции [ 9 ]. EPC играют важную роль в регенерации сосудистого эндотелия и восстановлении эндотелиального повреждения в сосудистых руслах. Трейш и Галузиан сообщили, что предполагаемые EPC, выделенные из периферической крови человека, экспрессируют два антигена, CD43 и Flk-1 [ 9 ]. В настоящем исследовании мы использовали эти маркеры для проверки существования и локализации EPC в кавернозном теле у крыс.

Мы обнаружили, что EPCs составляют приблизительно 3,31% популяции половых клеток и присутствуют в пещеристых телах и Tunica albuginea. Двойные окрашенные EPC CD34 и Flk-1 были обнаружены в области кавернозного синусоидального эндотелия. EPC характеризуются как CD34 + гематопоэтические предшественники из популяций, которые экспрессируют CD34, CD133 и VE-кадгерин, а также маркеры Flk-1 [ 10 ], тогда как циркулирующие EPC экспрессируют различные маркеры и характеризуются как CD34 + / Flk-1 + / VE-кадгерин + [ 10 ]. CD34 и Flk-1 экспрессируются как в ранних EPC, так и в поздних EPC. Коэкспрессия CD34 и Flk-1 или CD34 и VE-кадгерина широко использовалась для обнаружения EPC [ 9 , 11 ]. В настоящем исследовании мы подтвердили присутствие в иммунореактивных EPC CD34 и Flk-1 или CD34 и VE-кадгерина в кавернозном теле с помощью проточной цитометрии. Klein et al. ранее сообщалось о существовании резидентных «боковых популяций» клеток, которые имеют фенотипические и функциональные свойства клеток-предшественников в среде туники взрослых мышей аорты [ 12 ]. Они обнаружили, что сосудистые клетки-предшественники составляют 6% нормальной артериальной стенки.

Зенгин и соавт. сообщили о существовании ЭПК в сосудистой стенке, локализованной между гладкой мышцей и адвентициальным слоем сосудистой стенки взрослого [ 6 , 9 ]. Они предположили, что эта сосудистая зона в сосудистой стенке может служить источником клеток-предшественников для постнатального васкулогенеза. Существование резидентных EPC также было определено в таких тканях, как сердце и желтое тело [ 1 - 3 ]. Образцы яичников, содержащие corpora lutea от взрослых коров, экспрессировали мРНК CD133, CD34 и Flk-1, а также двойные позитивные клетки CD34 и Flk-1 были обнаружены в среде стенки артериального сосуда. В текущем исследовании CD34 + / Flk-1 + и CD34 + / VE-кадгерин + дважды положительные клетки были локализованы в кавернозном синусоидальном эндотелиальном слое (рисунки и). В нормальной сосудистой стенке EPCs были идентифицированы в субэндотелиальном пространстве и сосудистой адвентиции вблизи оболочки туники [ 12 ].

Роль EPCs в постнатальной жизни постулируется как поддержание нормальной физиологии сосудов, а также способствует регенерации сосудов [ 13 ]. Присутствие EPC в кавернозном синусоидальном эндотелиальном слое может иметь потенциал для восстановления поврежденного эндотелия. Эндотелиальный монослой кавернозного тела играет существенную роль в сосудистой гемодинамике эрекции полового члена. Любые условия, которые изменяют эндотелиальную функцию, таким образом нарушая биологическую активность и функциональную целостность, влияют на эректильную функцию. Интенсивные исследования были проведены для выявления сосудистых факторов риска, которые нарушают эндотелиальную функцию полового члена и приводят к васкулогенной эректильной дисфункции [ 1 ]. Следовательно, стратегии лечения васкулогенной эректильной дисфункции были направлены на улучшение эндотелиальной функции пещеристого тела. Такие стратегии включают пероральные ингибиторы фосфодиэстеразы-5 и интракавернозное введение вазоактивных агентов [ 1 ].

В настоящем исследовании мы стремились идентифицировать и локализовать EPC в кавернозном теле на модели самца крысы. Таким образом, мы не исследовали функцию EPC, которые обладают свойствами, подобными стволовым клеткам, и зрелой эндотелиальной функцией. Необходимы дальнейшие исследования для изучения функциональных исследований изолированных эндотелиальных клеток-предшественников кавернозного тела.

Новые стратегии лечения включают терапевтический ангиогенез и терапию стволовыми клетками / генами для лечения эректильной дисфункции [ 14 ]. Были предприняты попытки ангиогенных факторов, таких как VEGF и bFGF, для восстановления нормальной функции сосудистой системы полового члена [ 14 , 15 ]. Обоснование состоит в том, что эти ангиогенные факторы могут заменить или восстановить поврежденные эндотелиальные клетки.

В заключение мы обнаружили существование EPCs в эндотелиальном слое пещеристого тела. Постулируется, что цитокины необходимы для процесса дифференцировки EPC в эндотелиальные клетки. Необходимы дальнейшие исследования для изучения регуляторных путей регенерации EPC различными факторами, включая кастрацию, тестостерон и факторы роста.

Подтверждение

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования, науки и технологий (2011-0014275).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что нет конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Рекомендации

1. Коста С., Вираг Р. Эндотелиально-эректильная дисфункция: существенное обновление. Журнал сексуальной медицины . 2009; 6 (9): 2390-2404. doi: 10.1111 / j.1743-6109.2009.01356.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 2. Рю Ж.-К., Джин Х.-Р., Инь Г.Н., Квон М.-Х., Сонг К.-М., Чой М.Дж., Пак Ж.-М., Дас Н.Д., Квон К. -D., Batbold D., Lee T., Gao ZL, Kim K.-W., Kim WJ, Suh J.-K. Эректильная дисфункция предшествует другим системным сосудистым заболеваниям из-за некомпетентных кавернозных эндотелиальных клеточно-клеточных соединений. Журнал урологии . 2013; 190 (2): 779–789. doi: 10.1016 / j.juro.2013.02.100. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 3. Зампетаки А., Киртон Дж. П., Сюй В. Восстановление сосудов эндотелиальными прогениторными клетками. Сердечно-сосудистые исследования . 2008; 78 (3): 413–421. doi: 10.1093 / cvr / cvn081. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 4. Foresta C., Caretta N., Lana A., Cabrelle A., Palù G., Ferlin A. Циркулирующие эндотелиальные прогениторные клетки у субъектов с эректильной дисфункцией. Международный журнал исследований импотенции . 2005; 17 (3): 288–290. doi: 10.1038 / sj.ijir.3901311. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 5. Эспозито К., Чотола М., Майорино М.И., Джулиано Ф., Авторорино Р., Де Сио М., Джаннини Е., Лензи А., Джульяно Д. Циркулирующие CD34 + KDR + эндотелиальные клетки-предшественники коррелируют с эректильной функцией и эндотелиальная функция у мужчин с избыточным весом. Журнал сексуальной медицины . 2009; 6 (1): 107-114. doi: 10.1111 / j.1743-6109.2008.01042.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 6. Зенгин Э., Чаладжур Ф., Гелинг У.М., Ито У.Д., Триде Х., Лауке Х., Вейль Дж., Райхеншпюрнер Х., Килич Н., Эргюн С. Эргун С. Резидентные клетки-предшественники сосудистой стенки: источник постнатального развития васкулогенез. Разработка . 2006; 133 (8): 1543–1551. doi: 10.1242 / dev.02315. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 7. Вернет Д., Нолацко Г., Кантини Л., Маги Т.Р., Цян А., Раджфер Дж., Гонсалес-Кадавид Н.Ф. Доказательства того, что остеогенные клетки-предшественники в белковой оболочке человека могут происходить из стволовых клеток: последствия для болезни пейрония , Биология репродукции . 2005; 73 (6): 1199–1210. doi: 10.1095 / biolreprod.105.041038. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 8. Трайш А.М., Тозелли П., Чон С.-Дж., Ким Н.Н. Накопление адипоцитов в пещеристом теле полового члена орхиэктомизированного кролика: потенциальный механизм вено-окклюзионной дисфункции при дефиците андрогенов. Журнал Андрологии . 2005; 26 (2): 242–248. [ PubMed ] [ Google ученый ] 9. Трайш А.М., Галузиан А. Андрогены модулируют эндотелиальную функцию и эндотелиальные клетки-предшественники в эректильной физиологии. Корейский журнал урологии . 2013; 54 (11): 721–731. doi: 10.4111 / kju.2013.54.11.721. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 10. Христов М., Вебер С. Эндотелиальные клетки-предшественники: характеристика, патофизиология и возможная клиническая значимость. Журнал клеточной и молекулярной медицины . 2004; 8 (4): 498-508. doi: 10.1111 / j.1582-4934.2004.tb00474.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 11. Schoen K., Hirschberg RM, Plendl J., Kaessmeyer S. Идентификация CD133-, CD34- и KDR-позитивных клеток в бычьем яичнике: новый сайт резидентных эндотелиальных клеток-предшественников сосудистой стенки. Клиническая гемореология и микроциркуляция . 2012; 52 (2-4): 67–84. doi: 10.3233 / CH-2012-1585. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 12. Клейн Д., Хон Х.-П., Клефф В., Тилки Д., Эргюн С. Стеновые клетки-резиденты сосудистой стенки. Гистология и гистопатология . 2010; 25 (5): 681–689. [ PubMed ] [ Google ученый ] 13. Psaltis PJ, Harbuzariu A., Delacroix S., Holroyd EW, Simari RD Резидентные клетки-предшественники сосудистых клеток различного происхождения, фенотипа и функции. Журнал сердечно-сосудистых трансляционных исследований . 2011; 4 (2): 161-176. doi: 10.1007 / s12265-010-9248-9. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 14. Лисиак Дж.Дж., Кавусси П.К., Эллати Р.Т., Стиерс В.Д., Приложение Б.Н. Ангиогенезотерапия для лечения эректильной дисфункции. Журнал сексуальной медицины . 2010; 7 (7): 2554-2563. doi: 10.1111 / j.1743-6109.2010.01830.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 15. Лин С.-С., Синь З.-С., Ван З., Дэн С., Хуан Ю.-С., Лин Г., Лю Т.Ф. Лечение стволовыми клетками при эректильной дисфункции: критический обзор. Стволовые клетки и развитие . 2012; 21 (3): 343–351. doi: 10.1089 / scd.2011.0303. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] Статьи от BioMed Research International предоставлены здесь любезно предоставленной Hindawi Limited